最高法院:可追加公司股东为被执行人的11种法定情形

执行难一直是困扰法院、律师和当事人的一个很大的问题。那么,当公司不能清偿生效法律文书确定的债务的情况下,申请执行人在什么情况下可以申请变更、追加其投资人(股东)为被执行人呢?根据最高人民法院发布的《关于民事执行中变更、追加当事人若干问题的规定》,总结如下:

01、作为被执行人的个人独资企业,不能清偿生效法律文书确定的债务,申请执行人申请变更、追加其投资人为被执行人的,人民法院应予支持。个人独资企业投资人作为被执行人的,人民法院可以直接执行该个人独资企业的财产。

02、作为被执行人的合伙企业,不能清偿生效法律文书确定的债务,申请执行人申请变更、追加普通合伙人为被执行人的,人民法院应予支持。

作为被执行人的有限合伙企业,财产不足以清偿生效法律文书确定的债务,申请执行人申请变更、追加未按期足额缴纳出资的有限合伙人为被执行人,在未足额缴纳出资的范围内承担责任的,人民法院应予支持。

03、作为被执行人的法人分支机构,不能清偿生效法律文书确定的债务,申请执行人申请变更、追加该法人为被执行人的,人民法院应予支持。法人直接管理的责任财产仍不能清偿债务的,人民法院可以直接执行该法人其他分支机构的财产。

作为被执行人的法人,直接管理的责任财产不能清偿生效法律文书确定债务的,人民法院可以直接执行该法人分支机构的财产。

04、个人独资企业、合伙企业、法人分支机构以外的其他组织作为被执行人,不能清偿生效法律文书确定的债务,申请执行人申请变更、追加依法对该其他组织的债务承担责任的主体为被执行人的,人民法院应予支持。

05、作为被执行人的企业法人,财产不足以清偿生效法律文书确定的债务,申请执行人申请变更、追加未缴纳或未足额缴纳出资的股东、出资人或依公司法规定对该出资承担连带责任的发起人为被执行人,在尚未缴纳出资的范围内依法承担责任的,人民法院应予支持。

06、作为被执行人的企业法人,财产不足以清偿生效法律文书确定的债务,申请执行人申请变更、追加抽逃出资的股东、出资人为被执行人,在抽逃出资的范围内承担责任的,人民法院应予支持。

07、作为被执行人的公司,财产不足以清偿生效法律文书确定的债务,其股东未依法履行出资义务即转让股权,申请执行人申请变更、追加该原股东或依公司法规定对该出资承担连带责任的发起人为被执行人,在未依法出资的范围内承担责任的,人民法院应予支持。

08、作为被执行人的一人有限责任公司,财产不足以清偿生效法律文书确定的债务,股东不能证明公司财产独立于自己的财产,申请执行人申请变更、追加该股东为被执行人,对公司债务承担连带责任的,人民法院应予支持。

09、作为被执行人的公司,未经清算即办理注销登记,导致公司无法进行清算,申请执行人申请变更、追加有限责任公司的股东、股份有限公司的董事和控股股东为被执行人,对公司债务承担连带清偿责任的,人民法院应予支持。

10、作为被执行人的法人或其他组织,被注销或出现被吊销营业执照、被撤销、被责令关闭、歇业等解散事由后,其股东、出资人或主管部门无偿接受其财产,致使该被执行人无遗留财产或遗留财产不足以清偿债务,申请执行人申请变更、追加该股东、出资人或主管部门为被执行人,在接受的财产范围内承担责任的,人民法院应予支持。

11、作为被执行人的法人或其他组织,未经依法清算即办理注销登记,在登记机关办理注销登记时,第三人书面承诺对被执行人的债务承担清偿责任,申请执行人申请变更、追加该第三人为被执行人,在承诺范围内承担清偿责任的,人民法院应予支持。

(2016年8月29日最高人民法院审判委员会第1691次会议通过,自2016年12月1日起施行)

为正确处理民事执行中变更、追加当事人问题,维护当事人、利害关系人的合法权益,根据《中华人民共和国民事诉讼法》等法律规定,结合执行实践,制定本规定。

第一条执行过程中,申请执行人或其继承人、权利承受人可以向人民法院申请变更、追加当事人。申请符合法定条件的,人民法院应予支持。

第二条作为申请执行人的公民死亡或被宣告死亡,该公民的遗嘱执行人、受遗赠人、继承人或其他因该公民死亡或被宣告死亡依法承受生效法律文书确定权利的主体,申请变更、追加其为申请执行人的,人民法院应予支持。

作为申请执行人的公民被宣告失踪,该公民的财产代管人申请变更、追加其为申请执行人的,人民法院应予支持。

第三条作为申请执行人的公民离婚时,生效法律文书确定的权利全部或部分分割给其配偶,该配偶申请变更、追加其为申请执行人的,人民法院应予支持。

第四条作为申请执行人的法人或其他组织终止,因该法人或其他组织终止依法承受生效法律文书确定权利的主体,申请变更、追加其为申请执行人的,人民法院应予支持。

第五条作为申请执行人的法人或其他组织因合并而终止,合并后存续或新设的法人、其他组织申请变更其为申请执行人的,人民法院应予支持。

第六条作为申请执行人的法人或其他组织分立,依分立协议约定承受生效法律文书确定权利的新设法人或其他组织,申请变更、追加其为申请执行人的,人民法院应予支持。

第七条作为申请执行人的法人或其他组织清算或破产时,生效法律文书确定的权利依法分配给第三人,该第三人申请变更、追加其为申请执行人的,人民法院应予支持。

第八条作为申请执行人的机关法人被撤销,继续履行其职能的主体申请变更、追加其为申请执行人的,人民法院应予支持,但生效法律文书确定的权利依法应由其他主体承受的除外;没有继续履行其职能的主体,且生效法律文书确定权利的承受主体不明确,作出撤销决定的主体申请变更、追加其为申请执行人的,人民法院应予支持。

第九条申请执行人将生效法律文书确定的债权依法转让给第三人,且书面认可第三人取得该债权,该第三人申请变更、追加其为申请执行人的,人民法院应予支持。

第十条作为被执行人的公民死亡或被宣告死亡,申请执行人申请变更、追加该公民的遗嘱执行人、继承人、受遗赠人或其他因该公民死亡或被宣告死亡取得遗产的主体为被执行人,在遗产范围内承担责任的,人民法院应予支持。继承人放弃继承或受遗赠人放弃受遗赠,又无遗嘱执行人的,人民法院可以直接执行遗产。

作为被执行人的公民被宣告失踪,申请执行人申请变更该公民的财产代管人为被执行人,在代管的财产范围内承担责任的,人民法院应予支持。

第十一条作为被执行人的法人或其他组织因合并而终止,申请执行人申请变更合并后存续或新设的法人、其他组织为被执行人的,人民法院应予支持。

第十二条作为被执行人的法人或其他组织分立,申请执行人申请变更、追加分立后新设的法人或其他组织为被执行人,对生效法律文书确定的债务承担连带责任的,人民法院应予支持。但被执行人在分立前与申请执行人就债务清偿达成的书面协议另有约定的除外。

第十三条作为被执行人的个人独资企业,不能清偿生效法律文书确定的债务,申请执行人申请变更、追加其投资人为被执行人的,人民法院应予支持。个人独资企业投资人作为被执行人的,人民法院可以直接执行该个人独资企业的财产。

第十四条作为被执行人的合伙企业,不能清偿生效法律文书确定的债务,申请执行人申请变更、追加普通合伙人为被执行人的,人民法院应予支持。

第十五条作为被执行人的法人分支机构,不能清偿生效法律文书确定的债务,申请执行人申请变更、追加该法人为被执行人的,人民法院应予支持。法人直接管理的责任财产仍不能清偿债务的,人民法院可以直接执行该法人其他分支机构的财产。

第十六条个人独资企业、合伙企业、法人分支机构以外的其他组织作为被执行人,不能清偿生效法律文书确定的债务,申请执行人申请变更、追加依法对该其他组织的债务承担责任的主体为被执行人的,人民法院应予支持。

第十七条作为被执行人的企业法人,财产不足以清偿生效法律文书确定的债务,申请执行人申请变更、追加未缴纳或未足额缴纳出资的股东、出资人或依公司法规定对该出资承担连带责任的发起人为被执行人,在尚未缴纳出资的范围内依法承担责任的,人民法院应予支持。

第十八条作为被执行人的企业法人,财产不足以清偿生效法律文书确定的债务,申请执行人申请变更、追加抽逃出资的股东、出资人为被执行人,在抽逃出资的范围内承担责任的,人民法院应予支持。

第十九条作为被执行人的公司,财产不足以清偿生效法律文书确定的债务,其股东未依法履行出资义务即转让股权,申请执行人申请变更、追加该原股东或依公司法规定对该出资承担连带责任的发起人为被执行人,在未依法出资的范围内承担责任的,人民法院应予支持。

第二十条作为被执行人的一人有限责任公司,财产不足以清偿生效法律文书确定的债务,股东不能证明公司财产独立于自己的财产,申请执行人申请变更、追加该股东为被执行人,对公司债务承担连带责任的,人民法院应予支持。

第二十一条作为被执行人的公司,未经清算即办理注销登记,导致公司无法进行清算,申请执行人申请变更、追加有限责任公司的股东、股份有限公司的董事和控股股东为被执行人,对公司债务承担连带清偿责任的,人民法院应予支持。

第二十二条作为被执行人的法人或其他组织,被注销或出现被吊销营业执照、被撤销、被责令关闭、歇业等解散事由后,其股东、出资人或主管部门无偿接受其财产,致使该被执行人无遗留财产或遗留财产不足以清偿债务,申请执行人申请变更、追加该股东、出资人或主管部门为被执行人,在接受的财产范围内承担责任的,人民法院应予支持。

第二十三条作为被执行人的法人或其他组织,未经依法清算即办理注销登记,在登记机关办理注销登记时,第三人书面承诺对被执行人的债务承担清偿责任,申请执行人申请变更、追加该第三人为被执行人,在承诺范围内承担清偿责任的,人民法院应予支持。

第二十四条执行过程中,第三人向执行法院书面承诺自愿代被执行人履行生效法律文书确定的债务,申请执行人申请变更、追加该第三人为被执行人,在承诺范围内承担责任的,人民法院应予支持。

第二十五条作为被执行人的法人或其他组织,财产依行政命令被无偿调拨、划转给第三人,致使该被执行人财产不足以清偿生效法律文书确定的债务,申请执行人申请变更、追加该第三人为被执行人,在接受的财产范围内承担责任的,人民法院应予支持。

第二十六条被申请人在应承担责任范围内已承担相应责任的,人民法院不得责令其重复承担责任。

第二十七条执行当事人的姓名或名称发生变更的,人民法院可以直接将姓名或名称变更后的主体作为执行当事人,并在法律文书中注明变更前的姓名或名称。

第二十八条申请人申请变更、追加执行当事人,应当向执行法院提交书面申请及相关证据材料。

除事实清楚、权利义务关系明确、争议不大的案件外,执行法院应当组成合议庭审查并公开听证。经审查,理由成立的,裁定变更、追加;理由不成立的,裁定驳回。

执行法院应当自收到书面申请之日起六十日内作出裁定。有特殊情况需要延长的,由本院院长批准。

第二十九条执行法院审查变更、追加被执行人申请期间,申请人申请对被申请人的财产采取查封、扣押、冻结措施的,执行法院应当参照民事诉讼法第一百条的规定办理。

申请执行人在申请变更、追加第三人前,向执行法院申请查封、扣押、冻结该第三人财产的,执行法院应当参照民事诉讼法第一百零一条的规定办理。

第三十条被申请人、申请人或其他执行当事人对执行法院作出的变更、追加裁定或驳回申请裁定不服的,可以自裁定书送达之日起十日内向上一级人民法院申请复议,但依据本规定第三十二条的规定应当提起诉讼的除外。

第三十一条上一级人民法院对复议申请应当组成合议庭审查,并自收到申请之日起六十日内作出复议裁定。有特殊情况需要延长的,由本院院长批准。

被裁定变更、追加的被申请人申请复议的,复议期间,人民法院不得对其争议范围内的财产进行处分。申请人请求人民法院继续执行并提供相应担保的,人民法院可以准许。

第三十二条被申请人或申请人对执行法院依据本规定第十四条第二款、第十七条至第二十一条规定作出的变更、追加裁定或驳回申请裁定不服的,可以自裁定书送达之日起十五日内,向执行法院提起执行异议之诉。

被申请人提起执行异议之诉的,以申请人为被告。申请人提起执行异议之诉的,以被申请人为被告。

第三十三条被申请人提起的执行异议之诉,人民法院经审理,按照下列情形分别处理:

(一)理由成立的,判决不得变更、追加被申请人为被执行人或者判决变更责任范围;

诉讼期间,人民法院不得对被申请人争议范围内的财产进行处分。申请人请求人民法院继续执行并提供相应担保的,人民法院可以准许。

第三十四条申请人提起的执行异议之诉,人民法院经审理,按照下列情形分别处理:

(一)理由成立的,判决变更、追加被申请人为被执行人并承担相应责任或者判决变更责任范围;

最高法院院长周强解读:“基本解决‘执行难’”的标准是什么?是否达标谁来评判?

新京报快讯(记者 王姝)“我想,这个问题综合性比较强,想请周强院长回答”,10月25日上午,全国人大常委会专题询问两高专项报告现场,全国人大监察司法委副主任委员、中国法学会副会长张苏军点名最高法院院长周强回答问题。

张苏军提的问题,是关于基本解决“执行难”的标准。十八届四中全会提出,切实解决“执行难”;2016年3月,最高法提出,用两到三年时间基本解决“执行难”。“有一个如何合理确定标准的问题”,张苏军接连问了三个问题:基本解决“执行难”的标准是什么?谁来评判是否达标?是不是达标以后,执行就不难了?

怎么理解“基本解决执行难”这个目标,这个目标怎么来衡量?周强回应说,基本解决“执行难”是一个阶段性目标。“用形象的四个字来讲,就是要叫做‘内外有无’”。

他解释说,“内”,首先是要解决人民反映的内部问题,解决法院自身存在的消极执行、选择执行、乱执行的问题;“外”,从外部环境来看,被执行人规避执行、抗拒执行,和外部干预的现象基本得到遏制;“有”,指有财产可执行的案件,要在法定期限内基本执行完毕;“无”,指无财产可执行的案件,结案标准把握不严、恢复执行不畅等问题要基本得到解决,“就是不能把执行不了的案件都纳到‘执行不能’这个范围,所以要严格控制这个标准,不能把 ‘执行不能’当做一个筐,把工作不力、执行不了的案件往这里面装”。

周强称,将“内外有无”具体量化为4个90%、1个80%的核心指标,有财产案件法定期限内执结率90%,无财产案件终结本次执行程序合格率也要90%以上,执行信访办结率全国法院达标率都要90%以上。

那么谁来评判基本解决“执行难”是否达标?“我们讲基本解决执行难,法院不能自说自话,一定要坚持以人民群众满意为标准。为了达到这个标准,我们委托中国社科院牵头,4个部门13家媒体、15名专家学者组成第三方评估机构进行评估,客观的进行评估,严格的评估,而且评估结果要及时向社会公布。在评估的过程中,我们坚持实事求是,严格防止弄虚作假,发现弄虚作假的要严肃查处”。

江西省高级人民法院院长葛晓燕:公布失信被执行人的有关信息符合法律规定

中国小康网北京3月12日电(《小康》杂志、小康全媒体记者 张志 报道)江西省高级人民法院院长葛晓燕12日出席十三届全国人大二次会议新闻中心记者会,就记者提出关于“处理好曝光和隐私保护之间的关系”的问题,回应群众的关切。

对于电子屏幕、“老赖”地图等经常曝光“老赖”信息,葛晓燕回应,“老赖”在法律意义上,叫做“失信被执行人”,是指有履行能力但是逃避执行、规避执行、抗拒执行的被执行人。被执行人一旦被纳入到“失信被执行人名单”,法院将依法对他进行信用惩戒,这在法律上是有明确依据的。《中华人民共和国民事诉讼法》第255条对此作了明确的规定,最高人民法院对这个规定又作了司法解释。因此,公布失信被执行人的有关信息,这是符合法律规定的。

隐私权是人的一项基本权利,受到法律的保护,人民法院对此高度重视,在执行工作中也严格依法保护,但葛晓燕一再强调,公布失信被执行人的相关信息和隐私保护之间并不矛盾。

首先,法院只是选择其中情节严重的失信被执行人,予以公开曝光,以敦促他们尽快履行法定义务,在社会上形成守信光荣、失信可耻的社会风尚。

其次,公开的内容严格限定在法律的范围之内。法律和司法解释没有规定可以公开的信息,人民法院一律不得公开。

最后,即使对依法可以公开的失信被执行人的信息,人民法院在公开的时候,也采取一些技术性处理,尽可能地保护隐私。

葛晓燕强调,公开曝光失信被执行人的相关信息,对于推进社会诚信建设和解决执行难有很好的推进作用。江西高院和江西日报社以及18家金融媒体共同打造了“法媒银”失信被执行人曝光台,具有公开曝光、联合惩戒、在线举报、自我监督等多项功能。一旦失信被执行人一处失信,往往就处处受限。然而,失信被执行人一旦履行了法定义务,这个平台立即对他的失信名单信息给予屏蔽,相关的联合惩戒措施也同时解除。这个平台同时也是江西省高级人民法院系统自我监督的一个平台,当事人可以通过这个平台查询到自己关注案件的办理进展,还可以在线举报、反映执行人员的违法违纪行为,法院都及时予以处理。葛晓燕指出三年来,这个“法媒银”平台在推进“法治江西、诚信江西”建设方面,在帮助攻坚执行难方面,都发挥了非常好的作用,得到了社会各界的充分认可。中宣部、最高人民法院以及银保监会三个部门联合发文,向全国予以推广。葛晓燕还表示会不断地完善这项制度,使其在助推法治进步和社会诚信体系建设方面发挥更大的作用,做出更大的贡献。

2019重庆大学生命科学学院硕士研究生复试工作实施细则

根据教育部有关研究生招生工作的相关要求,结合重庆大学研究生院《关于做好2019年硕士研究生招生考试复试工作的通知》(重大校研[2019]12号)的精神和学院实际,制定我院2019年硕士研究生复试录取工作的实施细则。

目前学校下达我院普通全日制硕士研究生招生计划共计32名(其中已接收推荐免试攻读硕士研究生6名)。

请考生按照重庆大学研究生招生信息网上发布的《重庆大学2019年硕士研究生招生考试复试相关事宜通知》的要求携带复试材料。

资格审查不合格者不予复试。对提供虚假信息或材料,一经核实将取消复试资格、录取入学资格直至取消学籍和学历学位,责任由考生自负。

1.所有参加复试的考生(本校应届生除外),凭复试通知书(含电子照片)在2019年3月2022日期间(每天上午8:00-12:00)到重庆大学虎溪校区校医院进行体检。

2.3月22日上午9:0012:00到重庆大学虎溪校区理科大楼生命科学学院LB113办公室进行资格审查,不能按时到校进行资格审查的考生视为自动放弃复试资格。请带齐复试所需要的资格审查材料,同时交纳复试费:150元/人。同等学力考生、国家承认学历的本科结业生、成人教育应届本科毕业生、复试时尚未取得本科毕业证书的自考和网络教育考生,还须缴纳加试费100元/每人。

3.3月22日下午15:0017:00参加专业笔试(满分100分,占复试总成绩的30%)。专业课考试科目详见《重庆大学2019年硕士研究生招生专业目录》。同等学力考生、国家承认学历的本科结业生、成人教育应届本科毕业生、复试时尚未取得本科毕业证书的自考和网络教育考生,在复试时还须加试与报考学科相关的且不同于初试科目的本科专业两门主干课程,满分100分/门。加试成绩不计入复试成绩。

4.3月23日上午9:00参加实验技能考试(满分100分,占复试总成绩的30%)。

5.3月23日下午14:00进行综合面试(满分100分,占复试总成绩的40%)。

1.我院承德智体全面衡量、保证质量、择优录取、宁缺毋滥的原则,坚持公平、公正、公开。

2.复试成绩。满分100分,占考试总成绩的50%,包括专业笔试、实验技能测试及综合面试成绩之和。计算公式为:复试总成绩=专业笔试×30%+实验技能×30%+综合面试×40%.

3.总成绩:总成绩由初试成绩和复试成绩加权计算所得(初试成绩权重占50%、复试总成绩权重占50%),计算公式为:考试总成绩=初试成绩/5×50%+复试成绩×50%,并以考试总成绩分专业排序,按照研究生院分配的招生指标,择优录取。

1.我院实行责任负责制度和责任追究制度。所有参与复试的工作人员都要认真负责,严格保密,切实维护复试工作的公平、公正和公开,对违反招生纪律并造成严重后果者,将严肃查处。

2.学院研究生复试录取领导小组在复试成绩公布5日内接受考生申诉,对申诉问题经调查属实的责成复试小组复议,若考生对复议结果还有异议,则报学校研究生招生领导小组复议。

其余未尽事宜,遵照重庆大学研究生院“《关于做好2019年硕士研究生招生考试复试工作的通知》(重大校研[2019]12号)”相关规定执行。

地址:重庆市沙坪坝区大学城南路55号重庆大学虎溪校区理科大楼生命科学学院LB113室,邮编:401331。

生命科学研究热点基因突变的检测方法

多聚酶链反应技术是突变研究中的最重大进展,使基因突变检测技术有了长足的发展,目前几乎所有的基因突变检测的分子诊断技术都是建立于PCR的基础之上, 下面小析姐分别介绍几种PCR衍生技术及经典突变检测方法,可根据检测目的和实验室条件选择时参考。

基因突变的研究已成为当今生命科学研究的热点之一,检测方法也随之迅速发展。人类细胞癌基因的突变类型已如上所述,对于基因突变的检测,1985以前,利用Southern印迹法,可以筛选出基因的缺失、插入和移码重组等突变形式。对于用该法法不能检测的突变,只能应用复杂费时的DNA序列测定分析法。

多聚酶链反应(polymerasechainreaction,PCR)技术是突变研究中的最重大进展,使基因突变检测技术有了长足的发展,目前几乎所有的基因突变检测的分子诊断技术都是建立于PCR的基础之上,并且由PCR衍生出的新方法不断出现,目前已达二十余种,自动化程度也愈来愈高,分析时间大大缩短,分析结果的准确性也有 很 大 很 提 高 。 下面分别介绍几种PCR衍生技术及经典突变检测方法,可根据检测目的和实验室条件选择时参考。

PCR-SSCP 法是在非这性聚丙烯酰胺凝胶上,短的单链DNA 和RNA分子依其大街基序列不同而形成不同构象,一个碱基的改变将影响其构象而导致其在凝胶上的移动速度改变。其基本原理为单链DNA 在中性条件下会形成二级结构,这种二级结构依赖于其碱基组成,即使一个碱基的不同,也会形成不同的二级结构而出刺同的迁移率。由于该法简单快速,因而被广泛用于未知基因突变的检测。

用PCR-SSCP法检测小于200bp的PCR产物时,突变检出率可达70%-95%,片段大于400bp 时,检出率仅为50%左右,该法可能会存在1%的假阳性率。应用PCR-SSCP法应注意电泳的最佳条件,一般突变类型对检测的灵敏度无大的影响,同时该法不能测定突变的准确位点,还需通过序列分析来确定。Sarkar等认为对于大于200bp的片段,用其RNA分子来做SSCP 会提高其录敏度。

应用PCR-SSCP检测点突变已见报道于人类大部分的肿瘤组织或细胞,如乳腺癌、食管癌、肺癌、胃癌、肝癌、胰腺癌等。检测的基因包括多种癌基因及抑癌基因,也是检测抑癌基因p53突变最常用的方法,仅检测第5-8 外显子即可发现85%以上的p53 基因突变。由于该法简便快速,特别适合大样本基因突变研究的筛选工作。

HA法直接在变性凝胶上分离杂交的突变型一野生型DNA双链。由于突变和野生型DNA形成的异源杂合双链DNA在其错配处会形成一突起,在非变性凝胶中电泳时,会产生与相应的同源双DNA不同的迁移率。该法与SSCP相似,所不同的是SSCP分离的是单链DNA,HA法分离的是双链DNA,也只适合于小片段的分析。但HA 对一些不能用SSCP 检出的突变有互补作用,两者结合使用,可使突变检出率提高到近100%。

突变体富集PCR (mutant-enriched PCR),本法的基本原理是利用ras 基因家族某个密码子部位存在已知的限制性内切酶位点,如K-ras 基因第12 密码子的BstNI位点,第13 密古巴子有BgⅠⅡ位点。用链续二次的巢式PCR 来扩增包括K-ras第12、13 密码子的DNA片段,在两次扩增反应之间用相应的内切酶消化扩增的DNA片段,野生型因被酶切而不能进入第二次PCR扩增,而突变型则能完整进入第二次PCR 扩增并得到产物的富集。

变性梯度凝胶电泳法(denaturing gradinentelectrophoresis,DGGE),DGGE 法分析PCR产物,如果突变发生在最先解链的DNA区域,检出率可达100%,检测片段可达1kb,最适围为100bp-500bp。基本原理基于当双链DNA 在变性梯度凝胶中进行到与DNA变性湿度一致的凝胶位置时,DNA发生部分解链,电泳适移率下降,当解链的DNA链中有一个碱基改变时,会在不同的时间发生解链,因影响电泳速度变化的程度而被分离。

由于本法是利用温度和梯度凝胶迁移率来检测,需要一套专用的电泳装置,合成的PCR引物最好在5`末端加一段40bp-50bp的GC夹,以利于检测发生于高熔点区的突变。在DGGE的基础上,又发展了用湿度梯度代替化学变性剂的TGGE法(温度梯度凝胶电泳temperaturegradientgelelectrophoresis,TGGE)。DGGE和TGGE均有商品化的电泳装置,该法一经建立,操作也较简便,适合于大样本的检测筛选。

化学切割错配法(chemical cleavage ofmismatch,CCM),CCM 为在Maxam-Gilbert测序法的基础上发展的一项检测突变的技术,其检测突变的准确性可与DNA 测序相仿。其基本原理为将待测含DNA 片段与相应的野生型DNA片段或DNA 和RNA 片段混俣变性杂交,在异源杂合的双链核酸分子中,错配的C 能被羟胺或哌啶切割,错配的T能被四氧化饿切割,经变性凝胶电泳即可确定是否存在突变。

该法检出率很高,也是检片段最长的方法,已有报功检测了1.7kb片段,如果同时对正、反义链进行分析,检出率可达100%。应用荧光检测系统可增强敏感度,可检测到10 个细胞中的1个突变细胞。该法中的化学试剂有毒,又发展了碳二亚胺检测法(catodiimide,CDI),CDI 为无毒物质,也可检测大片段DNA 的点突变。

等位基因特异性寡核苷酸分析法(allele-specific oligonucleotide,ASO),ASO 为一种以杂交为基础对已知突变的检测技术。以PCR和ASO相结合,设计一段20bp左右的寡核苷酸片段,其中包含了发生突变的部位,以此为探针,与固定在膜上的经PCR 拉增的样品DNA杂交。可以用各种突变类型的寡核苷酸探针,同时以野生型探针为对照,如出现阳性杂交带,则表运河样品中存在与该ASO 探针相应的点突变,ASO 需严格控制杂交条件和设置标准对照避免假阳性和假阴性。目前已有商品化的检测盒检测部分癌基因ASO 突变。

DNA 芯片技术(DNA chip),DNA 芯片技术是90 年代后发展的一项DNA 分析新技术,它集合了集成电路计算机、激光共聚焦扫描、荧光标记探针和DNA 合成等先进技术。可用于基因定位、DNA 测序、物理图谱和遗传图谱的构建等。

在基因突变检测方面DNA芯片也有广阔的前景,其基本原理为将许多已知序列的寡核苷酸DNA排列在1块集成电路板上,彼此之间重叠1个碱基,并覆盖全部所需检测的基因,将荧光标记的正常DNA和突变DNA发别与2块DNA 芯片杂交,由于至少存在1个碱基的差异,正常和突变的DNA 将会得到不同的杂交图谱,经过共聚集显微镜分别检测两种DNA分子产生的荧光信号,即可确定是否存在突变,该方法快速简单、片动化程度高,具有很大的发展潜力,将在基因突变检测中心发挥非常重要的作用。

连接酶链反应(ligase chain reaction,LCR),与其他核酸扩增技术比较,其最大特点为可准确区分基因序列中单个基因突变,由Landegree于1988 年首次应用于镰刀奖细胞贫血的分子诊断。LCR是以DNA 连接酶将某一DNA链的5`-磷酸与另一相邻链3`-羟基连接为基础,应用两对互补的引物,双链DNA 经加热变性后,两对引物分别与模板复性,若完全互补,则在连接酶的作用下,使相邻两引物的5`-磷酸与3`-羟基形成磷酸二酯二酯键而连接,前一次的连接产物又作为下一次循环反应的模板,如果配对的碱基存在突变则不能连接和扩增。

LCR 产物检测最初是通过这32p 标记上游引物3`未端,经变性凝胶电泳分离后放射自显影加以鉴定,其检测敏感性达到200 个靶分子。也可设计1 个横跨两引物的检测探针, 用它与 LCR产物进行杂交检测。近年有应用荧光素、地高辛等非核素标记方法。

Batt在1994年发展了一种更为简的方法,好微孔板夹心杂交法。由于LCR 的快速、特蛋和敏感的特性,以及能检测单个碱基突变的能力,因此被应用于肿瘤基因突变的分子诊断,并与PCR结合用以提高其敏感性。

该法通过设计两个5`端引物,一个与正常DNA互补,一个与突变DNA互补,对于纯合性突变,分别加入这两种引物及3`端引物进行两个平行PCR,吸有与突变DNA完互补的引物才可延伸并得到PCR扩增产物。如果错配位于引物的3`端则导致PCR不能延伸,则称为ARMS。ARMS和ASPCR借鉴多重PCR原理,可在同一系统中同时检测两种或多种等位基因突变位点。

ASA 法的检出率依赖于反应条件的优化和可能发生的引物与靶DNA 有氏配时错配延伸,特别是当错配碱基为G:T时,这时可通过调整实验条件如引物靶DNA,TaqDNA 聚合酶的浓度等来得高瓜在特异性。在反应体系中加入甲酰胺也可减少非特异性扩增。还可通过在引物3`端的第二个碱基引入一个错配碱基,使之与模板之间形成双重错配以阻止错误延伸。

RNA 酶A切割法(RNase A cleavage),在一定条件下,氨基源双链核酸分子RNA:RNA或RNA:DNA中的错配碱基可被RNaseA切割,切割产物可通过变性凝胶电泳分离。当RNA 探针上错配的碱基为嘌呤时,RNaseA 在错配处的切割效率很低,甚至不切割,而当错配碱基为嘧啶时,则其切割效率较高。故如果仅分析被检DNA 的一个条链,突变检出率只有30%,如同时分析正义和反义二条链,检出率可达70%。该法需要制备RNA探针,增加了操作的复杂性,但可用于1-2kb 的大片段进行检测,并能确定突变位点。于这些优越性,它仍被作为一种经典方法用于对未知突变进行分析。

染色体原位杂交(In situ hybridization of chromosome),染色体发现距今已有150多年的历史,染色体检测被广泛用于动、植物及人类的细胞遗传学研究,随着染色体分技术和分子生物学技术的发展。染色体研究范围也不断扩大,特别是用于肿瘤分子诊断。肿瘤细胞的染色体变化是一非常普遍的现象,可分为原发和继发两类。

在肿瘤形成的生物学基础方面,原发性的染色体变化与引起肿瘤的直接原因有关,肿瘤细胞中可以发现各种形式的染色体畸变,如缺失、重复、易位、重排、单体断裂及核内复制等;继发性变化主要是肿瘤细胞核型的改变。染色体的检测对于肿瘤的诊断、鉴别诊断、生物学行为判别等方面都重要意义。染色体的检测方法进展很快,检测的精确率也不断提高,这里主要介绍荧光原位杂交和PRINS 法。

荧光原位杂交技术(fluorescent in situ hybridiaation,FISH)创建于1986年。1969年Gall和Pardue 首先应用核素标记核苷酸制备探针,通过放射自显影检测杂交信号。应用核素标记的探针其敏感性可以检测到中期染色体上几百个碱基的单拷贝靶核苷酸序列,敏感性虽高,但定位不够精确。FISH具有探针稳定、操作安全,可快速、多色显示多个不同探针的杂交信号等优点。

FISH 的灵敏感与探针标记方法和检测仪器性能有关,探针标记时掺入的修饰核苷酸比例直接影响杂交信号强度。FISH探针一般采用随机引物法或切口翻译法,如将PCR 技术引入FISH探针标记,可使其灵敏度提高到0.25kb。应用慢扫描CCD配合影像处理理软件,增强信噪比,有利于检测微弱信号,如应用TSA系统(tyramidesignalamplification)能将杂交信号再放大1000倍,可用于单拷贝基因的定位。

FISH 分辨率大约为1-3Mb,如果应用强变性剂处理染色体,让DNA分子从蛋白质中分离出来,使双DNA完全伸展并粘附在玻片上,经引处理后,分辨率可达1-2kb。还可采用对分裂中期染色体进行显微解剖(microdissect)法以提高分辨率。FISH 的另一个特点是可以联合庆用地高辛、生物素等多种标记系统, 在一次杂交中可检测多种探针在染色体上的位置及探针间的相互关系,即多色 FISH或多靶FISH。FISH 技术已被广泛应用于肿瘤研究中的基因扩增、易位重排及缺失等的检测,在肿瘤诊断和鉴别诊断、预后和治疗监控等方面都有重要意义。

Klch等于1989年发明了染色体上寡核苷酸引物原位DNA合成技术(oligonucleotideprimedinsituDNAsynthesis,PRINS),并成功地用于染色体特异α卫星DNA标记。其基本原理是用非标记的寡核苷酸引物同染色体上靶序列特异性地杂交,在DNA聚合酶作用下,当引物延伸时,掺入标记的核革酸可直接或间接地检量标记位点。PRINS技术的优点是不需克隆基因作探针,且由于杂交反应在前,标记在后,故非特异怀背景低。

缺点是信号弱,灵敏度低,为克服这一制眯,Terkelsen等建立了重复引物原位标记技术(repeatedPRINS),重复进行PRINS反应,使信号号强度明显提高。基于FISH的原理,发展了多色原位经物标记(multicolor PRINS),可测定二个以上靶序列在DNA 分子上的相互的位置, 且特异性比 FISH 还高。

DNA序列分析(DNAsequencing),应用各种突变检测技术检测到的基因突变,最后都需用序列分析才能确定突变类型及突变位置,其效率可以达到100%。现在的测序方法已与经典的方法有了很大的不同,其基本原理虽仍是双脱氧终止法,但自动化程度大为提高,操作更简便,测序时间也大大缩短。随着PCR技术与测序联合使用,不需经过M13亚克隆步骤,故称为直接测序法(directsequencing,DS)。

DS法测序的模板主主要来源于PCR,应用不对称 PCR(asymmetricPCR)和基因组扩增转录同步测序法(genomicamplificationwith transcriptsequencing,GAWTS)等,使单链产物大大增加。近年来,PCR循环测序法的建立,使模板扩增与同步进行,引物用四种不同前颜色的荧光标记,使每个样品的四个测序反应可在一个反应管和一个泳道内进行,大大提高了测邓的自动化程度。目前PE 公司推同出的DNA 自动测序仪已发展到96泳道,并仍在不断改进。这些高度自动化的测序方法是经较理想的基因突变分析技术,但其昂贵的费用其使用范围,所以对一些小样本或为了某些特定目的的样本分析,仍进行经典的手工测序。

突变基因的检测方法多种多样,特别是PCR技术诞生后,许多检测技术都是在PCR基础上衍生的。由于PCR扩增南非要的模板量少,使对肿瘤的突变分析可以精确到单细胞,如霍奇金病的R-S细胞的单细胞基因突变分析。另外,应用显微解剖法(microdissection)可在组织切片上较精确地挑选需检测的靶点,其优点是可克服肿瘤组只中间质或癌周组织的混杂,提高准确性。

bet365官方中文版中国在生命科学基础研究领域取得重要突破

国际在线报道(记者 张喆炯):2月22日,国际顶级学术期刊《CELL》(细胞)在线发表了中国军事科学院医学研究院的一项研究成果,这项新发现对于在抗病毒感染、重大传染病防控及自身免疫疾病的治疗领域具有重要科学意义。

这项新发现名为“环鸟腺苷酸合成酶(cGAS)抵抗病毒感染重要调控机理”,它是如何在抗病毒感染、重大传染病防控及自身免疫疾病的治疗领域发挥作用的呢?中国军事科学院军事医学研究院李涛博士在新闻发布会上介绍说:“cGAS这个蛋白质就是在胞浆里负责去感知外来DNA的这样一个感受器,那么当cGAS感受到病毒,它就会迅速合成一个小分子,并进一步激活下面的免疫反应,从而对病毒进行清除和抵抗。进一步的研究显示,cGAS除了在抗病毒感染方面有重要作用以外,它还是抗肿瘤免疫和自身免疫疾病治疗的重要的调控靶点,是不是可以通过灭活cGAS的方式,来关闭整条通路,从而去治疗这个疾病呢?那么通过一系列的质谱的分析,我们发现阿司匹林是可以直接乙酰化cGAS,并且抑制它的活性。这些数据就提示,阿司匹林就有可能治疗我们前述的疾病。”

李涛博士介绍,人类迄今已经认识的病毒可能仅占自然界病毒种类的1%。因此,如何在源头上掌握应对病毒感染及其所致重大疫情的主动权显得尤为重要。寻找有效控制cGAS活性的手段并探究其调控机制,对于有效抵抗病毒感染、重大传染病防控及自身免疫疾病的治疗都非常关键。

中国军事科学院军事医学研究院张学敏院士当天在新闻发布会上表示,现阶段除了做好cGAS乙酰化传递的功能以外,还将进一步探寻更有效的抑制剂。张学敏说:“我们现在已经发现的已经专利保护了,有关的推进看能不能够在临床上进行试验。另外一方面我们还要把现有的阿司匹林做更好的改进,让阿司匹林通过更好的结构改进,针对这个乙酰化传递的功能效率更高,减弱它有可能的副作用。当然我们也在寻找更有效的抑制剂。我们如果能够在这个cGAS这个更高的上游的位点上进行有效的干预的话,在我们需要激活的时候激活它,那么在抗肿瘤上来讲可能会有非常大的期盼。”

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军事科学院军事医学研究院在生命科学研究bet365官方中文版领域取得重要突破

澎湃新闻()记者从军事科学院军事医学研究院获悉,军事科学院军事医学研究院李涛博士和张学敏院士团队经过近5年潜心研究,成功发现细胞“门神”——环鸟腺苷酸合成酶(cGAS)抵抗病毒感染关键调控机理。这也是新的军事科学院调整组建后,在生命科学基础研究领域取得的重要科研突破之一。

北京时间2月22日凌晨,国际顶级学术期刊《Cell》(《细胞》)在线发表了相关研究论文。该院助理研究员戴江博士、博士生黄怡娇以及何新华博士是文章的共同第一作者,李涛和张学敏都是论文通讯作者。

当病毒入侵机体时,其自身遗传物质(如DNA等)会不可避免地被带入到宿主细胞中,继而导致机体针对这些外源DNA迅速做出强烈的免疫应答以清除病毒感染,甚至不惜以伤及自身为代价,这是病毒感染导致致死性炎症的主要原因。其中,DNA感受器cGAS蛋白质在DNA从细胞内部触发免疫和自身免疫反应中起到了关键作用。此外,除感受病毒入侵,cGAS的异常激活也是系统性红斑狼疮、AGS综合征等一类自身免疫疾病的关键致病因素。“寻找有效控制cGAS活性的手段并探究其调控机制,对抵抗病毒感染、重大传染病防控及自身免疫疾病的治疗都至关重要。”李涛博士介绍说。

围绕这个关键科学问题,李涛博士团队和张学敏院士团队展开了联合科研攻关,旨在从cGAS的调控机理研究入手,bet365官方中文版寻找控制cGAS激活的手段,以期为抗病毒感染和相关疾病的治疗寻找新的突破。经过近5年的深入研究,该团队发现乙酰化修饰是控制cGAS活性的关键分子事件,并揭示了其背后的调控规律。在药物设计专家何新华博士的具体参与下,研究人员综合利用生物质谱及色谱分析等技术,并通过特异位点乙酰化抗体等进行生物化学验证,最终发现乙酰水杨酸(阿司匹林)可以强制cGAS发生乙酰化并抑制cGAS的活性。随后,研究人员利用实验动物和AGS病人的细胞进一步验证了他们的发现。

军事医学研究院院长张士涛介绍说,由于cGAS在疾病发生和治疗中的重要作用,其干预手段一直是国际前沿领域的热点竞争方向,许多国际制药集团和科研团队都在试图寻找cGAS的干预手段。李涛博士和张学敏院士团队从机理研究入手,聚焦前沿、独辟蹊径,挖掘出百年老药阿司匹林可以通过乙酰化作用抑制cGAS激活。该工作不仅揭示了阿司匹林作用于人体的全新靶点和分子机制,还可能为一类目前无药可治的自身免疫疾病提供治疗方法。

在这一国际竞争激烈的前沿领域取得重要科研成果是军事科学院坚持从实验抓起大力推动科研创新的一个缩影。军事科学院领导告诉澎湃新闻记者,该院把抓好科学实验作为打造高水平军事科研机构的关键举措之一,他们系统梳理技术清单,调整资源投向投量,科学确定重点加强科研方向和重点培育科研方向,自主设计重大科研工程,重点抓好科研实验环境建设。目前,仅军事医学研究院就有3个国际组织指定实验室,1个国家重大科技基础设施,3个国家重点实验室。张学敏院士领衔的团队是“国家自然科学基金创新研究群体”,也是蛋白质组学国家重点实验室、抗毒药物与毒理学国家重点实验室的组成部分。长久以来,这个团队在张学敏院士培育的独特科学文化熏陶下,以十年磨一剑的定力潜心研究,矢志追求标志性创新。在刚刚过去的2018年岁末和2019年新年伊始,这个创新研究群体围绕抗病毒感染、机体能量应激供给和细胞对极端环境感应等领域取得了系列突破性进展。除《Cell》外,这些研究成果还先后发表在《Nature Immunology》(《自然·免疫学》)和《Nature Cell Biology》(《自然·细胞生物学》)等国际权威学术期刊上。

人类迄今已经认识的病毒可能仅占自然界病毒种类的1%。因此,如何在源头上掌握应对病毒感染及其所致重大疫情的主动权,是摆在科研人员面前的一项重要而艰巨的任务。张学敏院士说,该工作通过对抗病毒感染本质规律的揭示,使我们未来在应对重大疫情时,不仅对控制已知病毒感染具有手段,还有望对未知病毒感染具备应对能力。

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我是资深机长陈建国,5个月两次坠机,波音737 MAX 8有何问题,问吧!

南京中医药大学医学与生命科学学院2019年硕士研究生预调剂公告

南京中医药大学医学与生命科学学院2019年硕士研究生预调剂工作即将开始,欢迎优秀学子报考医学与生命科学学院硕士研究生。

南京中医药大学是江苏省人民政府与国家中医药管理局共建高校,2017年入围国家“双一流”建设和江苏高水平大学建设高校。学校始建于1954年,是全国建校最早的高等中医药院校之一。在全国第四轮学科评估中,中医学、中药学、中西医结合三个主干学科均进入A类。临床医学、药理学与毒理学2个学科进入ESI全球排名前1%,2017年入围U.S.News世界大学排行榜,2018年上榜自然指数国内高校TOP200,入围美国Scimago中国大学“学术”排名前128强。学校是全国首批博士学位、硕士学位授予单位,有中医学、中药学、中西医结合、护理学4个一级学科及中医1个专业学位博士学位授权点, 11个一级学科硕士学位及5个专业硕士学位授权点,3个博士后科研流动站。

医学与生命科学学院成立于2016年4月。学院下设8个学系,拥有省级教学实验示范中心、生物医学实验中心、受体功能及药物研究中心、生物技术研究中心以及江苏省退行性疾病药靶与药物重点实验室。学院现有教职工128人,其中教授16人,副教授24人,博士研究生导师14人,硕士研究生导师27人,国家“杰出青年科学基金获得者”2人,江苏省特聘教授6人。学院人才培养覆盖本科生、硕士及博士研究生各个层次。学院在中西医结合基础、中药学专业招收学术型博士研究生,在基础医学、生物学、中西医结合基础、药理学专业招收学术型硕士研究生,在药学专业招收专业型硕士研究生。学院与美国奥古斯塔大学乔治亚医学院、墨尔本皇家理工大学健康与生物医学学院以及台湾慈济大学医学院建立了良好的教学和科研合作关系。学院致力于培养具有社会责任感、创新精神、实践能力和国际视野的高素质人才,为国家输送在医学及生命科学研究领域的优秀人才。

所有调剂考生考研初试分数均需通过国家线,符合学校调剂基本要求,由学校统一遴选,择优复试。

2019年南京中医药大学医学与生命科学学院硕士研究生预调剂报名表.xls

安兔兔发布千元机性价比排行:荣耀第一华为第二!

近日,根据多家科技媒体的消息,国内手机评测机构安兔兔发布了2018年11月份1000—1999元手机性价比排行。对于1000—1999元的手机,属于千元机的范畴内。对于如今的国内智能手机市场,千元机可以基本上满足大部分用户的使用需求,而且因为价格上的优势,所以拥有非常广阔的用户群体。对于这份千元机性价比排行榜,数据来源为安兔兔评测,时间为(2018年11月1日—2018年11月30日)的国内安卓手机市场,并且以性价比评分的高低来排名。

具体来说,在2018年11月份的千元机性价比排行榜中,荣耀Play拿下了第一名的成绩,性价比评分为122.5分。在荣耀拿下第一后,华为也不甘示弱,旗下的华为nova 2s取得了第二名的成绩,性价比评分为118.5分。按照介绍,这款智能手机于2017年12月份发布。华为nova 2s搭载了麒麟960处理器,配备了6GB的运行内存,前置两颗2000万+200万像素双摄像头+全光谱还原柔光灯,后置2000万+1600万像素双F1.8大光圈摄像头。因为发布较早的缘故,这款手机的价格已经降低到了1000—1999元的范围内。

在荣耀和华为取得前两名的成绩后,小米6X排名第三,性价比评分为116.1分。在高通骁龙660处理器你的基础上,小米6X前后置镜头均达到了2000万像素,后置将采用竖排双摄像头的设计。对于这款上半年发布的千元机,因为价格上的不断降低,所以也获得了较高的性价比评分。在小米6X之后,vivo Z1和荣耀V10分列第四名和第五名。对于vivo这家国产智能手机,Z系列定位于中低端手机市场,而且主打性价比上的竞争优势。

最后,联想Z5和魅族X8分列第六名和第七名,性价比评分分别是106.1分和105.6分。其中,外观方面魅族X8采用了6.2英寸的LCD刘海屏。在处理器上,魅族的这款手机搭载了高通骁龙710处理器。也即在处理器上,这款千元机采用了中端手机芯片。在魅族X8之后,小米8 SE排名第八,和前者,小米8 SE也搭载了高通骁龙710处理器。360手机N7 Pro和见过Pro 2S分列第九名和第十名,这两款手机的性价比评分为104.0分和101.2分。总的来说,对于2018年11月份的安兔兔1000—1999元手机性价比排行,上榜的机型主要是几个月甚至去年发布的老款手机,因为价格上的下降,这些原先的中端手机被纳入到这份排行榜中了。

《王者荣耀》S15赛季什么时候开启? 限定皮肤有望返场你最期待哪一款?(一)

在王者荣耀这款游戏中,每三个月会开启一个新的赛季,如今S14赛季已经上线一个多月,很多玩家就开始关心S15赛季什么时候到来;因为天美在每个赛季初都会更新很多东西,比如水晶商店更新,限定皮肤返场等等。按照王者荣耀新赛季的更新规律,S14赛季是在1月20号开启的,按照三

在王者荣耀这款游戏中,每三个月会开启一个新的赛季,如今S14赛季已经上线一个多月,很多玩家就开始关心S15赛季什么时候到来;

因为天美在每个赛季初都会更新很多东西,比如水晶商店更新,限定皮肤返场等等。按照王者荣耀新赛季的更新规律,S14赛季是在1月20号开启的,按照三个月一次更新的规则,那么S15赛季将会在4月20号左右到来。不过具体还是要等官宣哦~

王者荣耀S14赛季上线才一个多月,因此新的S15赛季最少还有两个月的时间才会到来。再加上一些活动更新和天美的推迟因素,S15赛季最晚会在四月低开启,最迟不会到五月份。

玩家们除了关心新赛季的开启时间之外,还有就是新赛季更新的内容了,S15赛季更新的时候,王者荣耀的水晶商店也会进行更新。特别是最近一段时间新英雄马超频频被曝光,因此很多人认为水晶商店会更新马超,但是这是不可能的,因为水晶商店的更新有个隐藏规则:一个英雄,剩下的全是皮肤和一些特效道具,所以王者荣耀S15赛季更新之后,水晶商店最有可能更新的就是一款新的皮肤。

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